CAS9質(zhì)粒系列

CRISPR/Cas基因組編輯工具系統(tǒng)涉及到sgRNA和Cas9兩種成分。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9蛋白在單一的向?qū)NA(sgRNA)引導(dǎo)下識(shí)別并切割基因組上的目標(biāo)靶位點(diǎn)，從而在基因組上人為定向制造出雙鏈斷裂(DSB)。DSB一旦形成，會(huì)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性的DNA損傷修復(fù)機(jī)制以修復(fù)DSB。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)包括非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)、微同源介導(dǎo)的末端連接修復(fù)(MMEJ)和同源重組修復(fù)(HR)等三種主要形式。前兩種修復(fù)均為易錯(cuò)修復(fù)，修復(fù)的結(jié)果是在DSB附近形成插入/缺失突變。如果插入/缺失突變是個(gè)移碼突變且發(fā)生在關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的外顯子上，則可能使目標(biāo)基因因移碼而不能編碼出有活性的蛋白，從而成為一種無效等位基因，結(jié)果導(dǎo)致基因敲除;如果同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)提供同源供體，則這些供體會(huì)有機(jī)會(huì)被當(dāng)作用于DSB修復(fù)的同源供體，結(jié)果細(xì)胞通過HR修復(fù)，成功實(shí)現(xiàn)在指定位置的基因敲入。

pYSY-CMV-dCas9-KRAB-U6-sgRNA-EF1a-Puromycin