作為最先進(jìn)、最熱門的基因編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9技術(shù)被廣泛用于編輯哺乳動物細(xì)胞的基因組，具有非常巨大的臨床應(yīng)用潛能。目前，CRISPR為基礎(chǔ)的療法已經(jīng)開始臨床試驗(yàn)（NCT03655678、NCT03399448），以研究其安全性和可行性，但試驗(yàn)的結(jié)果還沒有報(bào)道。
同種異體移植天然攜帶CCR5突變的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）能夠長期根除HIV-1，CCR5是HIV入侵的關(guān)鍵共受體。10年前，曾有一位感染了HIV-1的“柏林患者”通過造血干細(xì)胞移植治療急性髓系白血病，而供體細(xì)胞恰具有CCR5Δ32/Δ32 突變，骨髓移植后，患者的HIV得到長期緩解【1】。但是當(dāng)時(shí)那個(gè)單一的病例并不能反映到底哪種治療手段或患者因素是緩解HIV的原因，畢竟骨髓移植手術(shù)還需要進(jìn)行全身輻射。
10年后的2019年3月6日，來自英國倫敦大學(xué)學(xué)院、劍橋大學(xué)等處的科學(xué)家在Nature發(fā)表的一篇題為HIV-1 remission following CCR5Δ32/Δ32 haematopoietic stem-cell transplantation 的論文【2】，報(bào)告世界上第二例經(jīng)干細(xì)胞移植后HIV-1感染得以緩解的病例。截止到論文發(fā)表的時(shí)間為止，患者的病情已經(jīng)緩解了18個(gè)月，但是作者提醒，要說患者的艾滋病已經(jīng)“被治愈”還為時(shí)尚早。
因此移植人為突變CCR5的細(xì)胞或許是抵抗HIV-1感染的替代性療法。2017年8月，北京大學(xué)鄧宏魁教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合307醫(yī)院陳虎實(shí)驗(yàn)室發(fā)展出一種無病毒的CRISPR基因組編輯系統(tǒng)【3】，在人HSPCs中突變CCR5，效率達(dá)到27%；而且在小鼠模型中顯示，CCR5突變的HSPCs能夠在小鼠中重建人類免疫系統(tǒng)，抵抗HIV-1感染。那么CCR5編輯的HSPCs在人體內(nèi)是否能夠抵抗HIV感染，其安全性和有效性又是如何呢？
2019年9月11日，鄧宏魁教授、307醫(yī)院的陳虎教授（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍造血干細(xì)胞研究所所長、教授，軍事醫(yī)學(xué)研究院原附屬醫(yī)院造血干細(xì)胞移植科主任醫(yī)師，2019年7月24日20時(shí)50分在北京因病不幸逝世，享年57歲）以及北京佑安醫(yī)院吳昊教授研究組合作在The New England Journal of Medicine雜志上發(fā)表文章CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia，報(bào)道了首例利用CRISPR-Cas9在HSPCs中編輯CCR5基因并成功移植到罹患HIV和急性淋巴細(xì)胞白血病的患者案例，移植治療使病人的急性淋巴白血病得到完全緩解，攜帶CCR5突變的供體細(xì)胞能夠在受體體內(nèi)長期存活達(dá)19個(gè)月，初步探索了該方法的可行性和安全性，但比例僅有5%，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方法?？梢灶A(yù)見的是，該臨床試驗(yàn)報(bào)告將會推動全球范圍內(nèi)基于CRISPR基因編輯手段用于臨床治療，其意義不言而喻。
據(jù)文中報(bào)道，該病人為27歲男性，在2016年5月14日和5月30日分別診斷患有HIV-AIDS和急性淋巴細(xì)胞白血病（T細(xì)胞型）。隨后立即接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，1年后HIV感染得到控制，在血清中檢測不到病毒RNA。病人接受6個(gè)療程標(biāo)準(zhǔn)的化療治療后，其形態(tài)上達(dá)到完全緩解。供體細(xì)胞來自中華骨髓供體庫的一名33歲男性，其HLA配型完全匹配，CCR5基因沒有突變。2017年7月9日，病人在清髓后，接受異體干細(xì)胞移植。干細(xì)胞移植的細(xì)胞由兩部分組成：動員后外周血單核細(xì)胞分離出CD34+HSPCs，接受CRISPR編輯CCR5基因；剩下的單核細(xì)胞（由于分離效率，有部分CD34+細(xì)胞，占總CD34+細(xì)胞的28.8%，也就是說71.2%的CD34+被分離出來進(jìn)行了基因編輯）。病人同時(shí)接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療、移植物抗宿主病預(yù)防用藥。
移植治療后，13天和27天分別出現(xiàn)中性粒細(xì)胞和血小板重建；淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞亞群增加，CD4細(xì)胞在6個(gè)月時(shí)恢復(fù)到正常范圍并穩(wěn)定；3個(gè)月時(shí)，血小板出現(xiàn)短暫減少，隨后自行恢復(fù)到正常范圍并穩(wěn)定；4周后，實(shí)現(xiàn)了完全的供體嵌合，并維持到了19個(gè)月。移植后4周，病人的急性淋巴白血病達(dá)到形態(tài)上的完全緩解，并維持到隨訪的19個(gè)月。
利用非病毒方式轉(zhuǎn)染CRISPR-Cas9對HSPCs（CD34+）細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，基因測序結(jié)果顯示CCR5發(fā)生插入和刪除突變（indel）的效率是17.8%。由于CD34+細(xì)胞分離效率限制，19個(gè)月長期的重建過程中，CCR5突變在骨髓有核細(xì)胞的比例范圍是5.20%到8.28%。CCR5突變比率顯示CD19+、CD33+、CD235a+細(xì)胞的編輯效率略高，CD4+、CD8+細(xì)胞稍低。結(jié)果顯示，CRISPR編輯的HSPCs成功在病人體內(nèi)重建，能夠分化成多種譜系細(xì)胞，并保持基因編輯狀態(tài)。
移植治療過程中，病人出現(xiàn)2～3度的造血干細(xì)胞移植常見的并發(fā)癥，經(jīng)常規(guī)治療后都得到緩解；沒有發(fā)現(xiàn)與CCR5基因編輯相關(guān)的副作用事件。利用高通量基因測序技術(shù)檢測基因編輯的脫靶效應(yīng)，經(jīng)過綜合排查，僅有14個(gè)位點(diǎn)檢測出Indels，且僅有1bp的突變，經(jīng)逐個(gè)分析考慮并不是真正的脫靶事件。收集移植后15周、12個(gè)月、19個(gè)月的骨髓血樣本，全基因組測序檢測并無脫靶效應(yīng)，而且沒有染色體重排或長片段刪除。
之前的研究顯示自體移植CCR5突變T細(xì)胞能夠在中斷抗病毒治療期間，降低病人體內(nèi)的病毒載量【4】，提示CCR5刪除突變或許能替代長期使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。研究人員對CCR5編輯HSPCs能否抵抗HIV-1感染進(jìn)行測試。經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)及病人的同意后，暫時(shí)中斷抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，4周時(shí)血清中病毒載量增加到3*107/ml；恢復(fù)藥物治療后，病毒載量降低?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療中斷期間，外周血CD4+細(xì)胞降低，CD4/CD8比例降低；CD4+細(xì)胞中CCR5突變的比例有所增加。移植6個(gè)月后，CD4+細(xì)胞恢復(fù)至正常范圍。移植8個(gè)月和19個(gè)月后，檢測外周血樣本發(fā)現(xiàn)HIV病毒的噬性并沒有發(fā)生改變（依然為CCR5噬性）。
總的來說，本文報(bào)道了一例利用CRISPR編輯CCR5的HSPCs干細(xì)胞移植治療罹患HIV和急性淋巴白血病病人的案例。研究人員利用一種新型的非病毒轉(zhuǎn)染方式高效率地編輯CCR5基因，編輯的干細(xì)胞能夠分化成多種譜系細(xì)胞，且保留CCR5編輯效果，維持達(dá)19個(gè)月；本次干細(xì)胞移植治療使病人的急性淋巴白血病得到形態(tài)上完全緩解，另外也并沒有出現(xiàn)明顯的編輯后副反應(yīng)，但對抵制HIV感染效果欠佳，需要進(jìn)一步探索。
值得一提的是，鄧宏魁教授正是CCR5的發(fā)現(xiàn)者。在1996年發(fā)表的一篇Nature文章中【5】，鄧宏魁教授在紐約大學(xué)從事博士后研究時(shí)（1995-1997年）作為第一作者發(fā)現(xiàn)了CC-CKR-5（即CCR5），該研究是HIV領(lǐng)域內(nèi)里程碑式的發(fā)現(xiàn)。目前該文章已被引用超過4300次。
值得一提的是，NEJM同期還發(fā)表了美國科學(xué)院院士、賓夕法尼亞大學(xué)終身教授Carl H. June撰寫的題為Emerging Use of CRISPR Technology — Chasing the Elusive HIV Cure的評論。評論認(rèn)為“該工作的安全狀況似乎是可以接受的，盡管相關(guān)數(shù)據(jù)僅限于該病例研究。值得注意的是，為了確保方法的安全性，需要更長時(shí)間對病人進(jìn)行隨訪。一個(gè)令人矚目的方面是，本研究報(bào)告將基礎(chǔ)研究快速轉(zhuǎn)化成為了臨床1期試驗(yàn)。而在賓夕法尼亞大學(xué)，從動物實(shí)驗(yàn)概念證實(shí)到人的臨床試驗(yàn)需要5年，而在本研究中只用了2年。”此外，Carl H. June對媒體還表示，“該研究對相關(guān)領(lǐng)域來說非常好，而且沒有引發(fā)倫理上的擔(dān)憂”。
https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1817426?query=featured_homehttps://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMe1910754
張林琦（清華大學(xué)艾滋病綜合研究中心主任）
自從1981年艾滋病的發(fā)現(xiàn)，1983年艾滋病病毒(HIV)被分離并確定為艾滋病病原體的三十多年以來，我們對HIV生物學(xué)和人體抗HIV免疫應(yīng)答開展了系統(tǒng)的研究，研發(fā)成功多種抗HIV藥物。這些藥物的優(yōu)化組合（雞尾酒療法）能夠有效抑制HIV的復(fù)制，為降低艾滋病患者的死亡率，降低HIV傳播，提高感染者的生活質(zhì)量起到了關(guān)鍵性的作用，使一種為早期醫(yī)學(xué)宣判為死刑的疾病轉(zhuǎn)為一種可治療和可控制的慢性疾病。但目前使用的這些抗HIV藥物，仍然無法把HIV從體內(nèi)根本清除。其主要原因是HIV的高度變異和潛藏在人體的細(xì)胞內(nèi)，巧妙地躲過了人體免疫系統(tǒng)和抗HIV藥物的識別，對治愈艾滋病提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
當(dāng)前，在艾滋病治愈的研究領(lǐng)域，活躍著三個(gè)主要的研究方向和策略。第一是潛藏庫的清除，其中如何特異識別和激活潛藏庫，并加以抑制和殺傷，是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。第二是利用多種免疫學(xué)手段，提高感染者抗病毒免疫水平，最終達(dá)到有效控制和徹底清除病毒的目標(biāo)。主要包括廣譜中和抗體、多種免疫細(xì)胞（CART，TCRT，CAR-NK等）、免疫因子和治療性疫苗的研究。第三是基因治療，利用近幾年逐步完善的基因編輯技術(shù)，比如ZFN，TALEN和CRISPR/Cas9等，開展對艾滋病病毒靶細(xì)胞的基因修飾，特別是對T淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞等體細(xì)胞第二受體CCR5基因的定點(diǎn)敲除，建立能夠抵抗艾滋病病毒感染的細(xì)胞屏障，重建免疫系統(tǒng)，達(dá)到“功能性治愈”和“完全治愈”的目的?！鞍亓植∪恕焙汀皞惗夭∪恕本褪抢谩疤烊弧盋CR5基因缺失（CCR5-Δ32）治愈艾滋病的典型范例。但由于這天然缺失在自然界概率少的可憐，因此，通過基因編輯敲除成體造血干細(xì)胞CCR5基因，再將編輯后的細(xì)胞移植到艾滋病患者體內(nèi)成為了“功能性治愈”艾滋病的新策略。有必要強(qiáng)調(diào)的是，這里面提到的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用是以體細(xì)胞為靶標(biāo)，與前一段時(shí)期報(bào)道的“賀建奎事件”中以生殖細(xì)胞和生殖為目的基因編輯CCR5基因，是完全不同的動機(jī)和目標(biāo)。
今天，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（The New England Journal of Medicine）發(fā)表了由北京大學(xué)鄧宏魁研究組、解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心陳虎研究組及北京佑安醫(yī)院吳昊研究組合作，在基因治療艾滋病研究的重要成果。研究論文的題目是《利用CRISPR基因編輯的成體造血干細(xì)胞在患有艾滋病合并急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的長期重建》（CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia）。這是世界上首次報(bào)道通過基因編輯技術(shù)敲除人體造血干細(xì)胞CCR5基因，回輸給患有艾滋病及急性淋巴細(xì)胞白血病患者，在安全性和有效性等研究方面，獲得了寶貴的數(shù)據(jù)，取得了長足的進(jìn)步，為我們進(jìn)一步完善利用基因編輯技術(shù)治療和治愈艾滋病提供了重要的參考和指導(dǎo)。
研究論文顯示，利用前期優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯造血干細(xì)胞技術(shù)，在供者來源的CD34+細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了17.8%的CCR5基因敲除效率。在移植后的19個(gè)月隨訪中，患者白血病處于完全緩解狀態(tài)，供者型細(xì)胞完全嵌合，骨髓細(xì)胞基因組能夠持續(xù)檢測到CCR5基因編輯。在探索治療艾滋病有效性方面，研究團(tuán)隊(duì)暫停了抗艾滋病藥物治療。在停藥期間，外周血病毒載量從檢測不到反彈到每毫升3×107拷貝，CD4+ T細(xì)胞數(shù)量從每微升的575下降到250。而帶有CCR5敲除的CD4+ T細(xì)胞從2.96%增加到4.39%，相當(dāng)于提高了1.5倍。提示CCR5基因編輯的T細(xì)胞具備抵御HIV的入侵的能力和一定程度的生存優(yōu)勢。此外，通過對患者移植后多個(gè)骨髓樣本的全基因組分析，并未發(fā)現(xiàn)基因編輯的脫靶效應(yīng)和相關(guān)的副作用。
這些研究成果表明，成體造血干細(xì)胞基因編輯和移植，在艾滋病及急性淋巴細(xì)胞白血病患者體內(nèi)具備良好的安全性和免疫重建的有效性。編輯后的成體造血干細(xì)胞能夠在患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因編輯效果，并重建人體造血系統(tǒng)。然而，對于艾滋病的治療效果與未經(jīng)過基因治療患者相比差別不大，主要反應(yīng)在短暫的停藥期間，病毒反彈和CD4+ T細(xì)胞下降等方面。這種現(xiàn)象的發(fā)生，很有可能是移植的成體造血干細(xì)胞本身是CCR5基因野生型和敲除的混合體，其中帶有野生型CCR5基因的CD4+T細(xì)胞，為病毒的復(fù)制和反彈提供了場所。從這個(gè)意義上講，報(bào)道的病人更接近于“波士頓病人”的情況，突顯提高基因編輯效率的重要性。此外，在停藥期間，帶有CCR5敲除的CD4+ T細(xì)胞比例和數(shù)量都有所增加，也許真的驗(yàn)證了人們所期待的那種敲除細(xì)胞面對艾滋病病毒感染的生存優(yōu)勢。由于病人隨后接受了抗病毒治療，對這個(gè)問題的回答還需要進(jìn)一步的研究。再者，反彈病毒的來源一直是困擾研究領(lǐng)域的難題。如何在成體造血干細(xì)胞基因編輯和移植之前，清除患者體內(nèi)的艾滋病病毒，防止嵌合免疫重建細(xì)胞感染，阻止病毒復(fù)制和反彈，同樣是提高治療效果的關(guān)鍵。
總之，今天的研究報(bào)告，為我們利用成體造血干細(xì)胞基因編輯和移植技術(shù)治療艾滋病提供了寶貴的信息和經(jīng)驗(yàn)，對一些關(guān)鍵的結(jié)論和臨床表現(xiàn)，還需要對患者開展長期隨訪觀察。但是隨著造血干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）研究的進(jìn)展，以及基因編輯技術(shù)和遞送效率的提高，我們有理由相信，新一代的基因編輯技術(shù)一定能夠在治療和治愈艾滋病的道路上發(fā)揮更大的作用。屆時(shí)，一定是對英年早逝的陳虎教授最好的追憶和懷念。
程臨釗（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)部講席教授，約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院終身教授）
中國人民解放軍307醫(yī)院（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心）陳虎研究組、北京大學(xué)鄧宏魁研究組以及北京佑安醫(yī)院吳昊研究組合作，在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）剛剛發(fā)表了題為CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia的原創(chuàng)性研究論文。這篇短幅的文章是基于CRISPR編輯人的成體造血干細(xì)胞，對HIV-1的目標(biāo)基因CCR5（共受體）進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn)了基因編輯后的成體造血干細(xì)胞移植后在此病人（該患者同時(shí)患有艾滋病和急性淋巴細(xì)胞白血?。┰煅到y(tǒng)的重建。他們經(jīng)過仔細(xì)的檢測，并沒有看到脫靶或其它的遺傳相關(guān)的副作用。該工作探索了使用基因編輯在人成體干細(xì)胞中精準(zhǔn)基因治療的可行性和安全性。相信這個(gè)剛剛發(fā)表的工作，會進(jìn)一步推動相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。CCR5也就是HIV-1入侵T細(xì)胞的共受體（鄧宏魁教授當(dāng)年是共同發(fā)現(xiàn)者之一）。在過去30多年都是HIV-1 病毒和艾滋病研究的關(guān)注對象。很多研究者也都在考慮怎么去除CCR5的生物學(xué)活性，從而得到可以抵抗HIV-1 入侵的T細(xì)胞，在過去十多年里最為出名的“柏林病人”和“倫敦病人”，由于供體造血干細(xì)胞正好攜帶CCR5缺陷型突變，血清中的HIV病毒得到了有效的清除。但這種方法的可推廣性是有限的，其中一個(gè)原因是天然的，有CCR5缺陷的供體是極少數(shù)，尤其在亞洲人群里面。因此很多科學(xué)家都嘗試通過不同的方法，比如用基因編輯，人為去除CCR5的活性。此研究是用成年供者的造血干細(xì)胞，通過基因編輯的方法突變 （滅活）CCR5基因，再通過經(jīng)典的造血干細(xì)胞移植回輸給病人。此艾滋病病人同時(shí)患有急性淋巴細(xì)胞白血病需要行異體造血干細(xì)胞移植治療。所以在突變CCR5并做了移植后，移植的造血干細(xì)胞生產(chǎn)的T細(xì)胞就能夠抵抗HIV-1的入侵。這篇轉(zhuǎn)化型的研究在很多方面都做得很出色。第一個(gè)是遵守了醫(yī)學(xué)倫理，有病人知情同意書，在按照國際規(guī)范做的很好；第二方面，在技術(shù)上也把他們過去幾年，尤其是鄧宏魁團(tuán)隊(duì)在過去數(shù)年中采用基因編輯的新技術(shù)，如非病毒的方法，把關(guān)鍵的蛋白和guideRNA的復(fù)合體，通過電轉(zhuǎn)的方法輸進(jìn)人的造血干細(xì)胞。這樣避免了外源DNA的引入，更沒有插入干細(xì)胞的染色體里面, 在干細(xì)胞里面也降低了存在的脫靶效應(yīng)。重要的是，此研究用人的成體造血干細(xì)胞做基因編輯. 雖然靶向基因也是CCR5，但是同去年被媒體大肆報(bào)道的賀建奎博士做的事有很大的不一樣。賀建奎博士采用的是人的受精卵,最終產(chǎn)生基因修飾的嬰兒。這樣人體生殖系和體細(xì)胞系所有的細(xì)胞都會有CCR5突變。雖然CCR5 基因滅活的初衷是，嬰兒的T細(xì)胞應(yīng)該抵抗HIV-1 的入侵和進(jìn)一步感染，但CCR5 基因滅活是否會對胚胎和成體細(xì)胞生理活性和功能的可能影響，現(xiàn)在不太明了。公開報(bào)道的賀建奎工作，眾所周知，有很多瑕疵和違規(guī)行為。目前具體細(xì)節(jié)還在進(jìn)一步的調(diào)查，但科學(xué)界和社會普遍譴責(zé)賀的以人類生殖為目的基因編輯工作。這篇剛在NEJM上發(fā)表的工作，本質(zhì)上是與賀的公共場合和媒體上報(bào)告不同。這次剛發(fā)表的工作，是在人的成體造血干細(xì)胞中做CCR5 的基因修飾。人類造血干細(xì)胞移植已經(jīng)用了50多年，基本上在全世界不管歐美國家還是在中國都沒有什么爭議。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)治愈和幫助了無數(shù)病人。此工作進(jìn)一步使用基因編輯，完善基因和細(xì)胞治療，使像這一類的絕癥病人也能夠得到有效的根治。最后我想說的是，此文章最后一位作者也是共同通訊作者陳虎教授是中國造血干細(xì)胞領(lǐng)域的優(yōu)秀人物，在此研究中起到關(guān)鍵的作用，只是不幸的是陳虎教授在此文章修訂期間英年早逝。這篇文章的發(fā)表也是對陳虎教授最好的懷念。
陳虎教授（1962-2019），全軍造血干細(xì)胞移植中心主任、全軍造血干細(xì)胞研究所所長、血液病專業(yè)委員會副主任，曾牽頭的“成體干細(xì)胞救治放射損傷新技術(shù)的建立與應(yīng)用”獲得國家科技進(jìn)步一等獎，“間充質(zhì)干細(xì)胞在急性放射病干細(xì)胞移植中誘導(dǎo)免疫耐受的研究”獲得軍隊(duì)科技進(jìn)步一等獎，2016年獲得“何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)進(jìn)步獎”。曾榮立一等功1次、二等功1次、三等功1次。姜錫娟 攝影
現(xiàn)在，國內(nèi)外有很多研究者進(jìn)一步推動和完善基因編輯在臨床上的應(yīng)用。除了艾滋病以外，此方法可用于其他血液和免疫系統(tǒng)的疾病治療，比如在國內(nèi)比較常見的血友病和地中海貧血等。此篇文章的發(fā)表也會有助于其他團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步完善相關(guān)技術(shù)。此研究除了艾滋病以外，對其他用造血干細(xì)胞治療的血液和免疫相關(guān)的疾病，都將會帶來新的推動。
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